PCR常見問題
圣賓儀器科技上海有限公司
問題1：假陰性（無擴(kuò)增產(chǎn)物）
現(xiàn)象：正對照有條帶，樣品無條帶
可能原因：
模板：含有Taq酶抑制劑、雜蛋白，模板上樣量低或模板降解
引物：引物降解，引物設(shè)計(jì)不合理
試劑：酶失活，buffer不合適
反應(yīng)條件：退火溫度高，延伸時(shí)間短
解決方法：
純化模板并重新提取，并檢測模板是否含有抑制劑
重新設(shè)計(jì)引物并低溫保存
優(yōu)化buffer，摸索鎂離子濃度或適當(dāng)加入DMSO（小于0.3%）
降低退火溫度，增加延伸時(shí)間（反應(yīng)條件參照試劑盒說明書）
問題2：假陽性
現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)條帶
可能原因：
引物設(shè)計(jì)不適，與目的序列具有同源性
試劑污染：水、移液槍等被核酸污染
樣品間出現(xiàn)交叉污染
解決方法：
實(shí)驗(yàn)儀器高壓滅菌
實(shí)驗(yàn)試劑（酶除外）高壓滅菌，離心管槍頭一次性使用
規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作
假陽性可通過巢式PCR解決，或者使用特異性較高的試劑盒擴(kuò)增
問題3：拖尾、彌散
現(xiàn)象：電泳出現(xiàn)拖尾、涂抹帶
可能原因：
酶用量過多
模板純度較低
dNTP、鎂離子濃度過高
循環(huán)次數(shù)過多
解決方法：
減少用酶量或使用特異性高的熱啟動酶擴(kuò)增
純化模板
減少dNTP用量，摸索鎂離子濃度
減少循環(huán)次數(shù)
問題4：二聚體及非特異性產(chǎn)物
一般小于100bp的條帶可基本判斷為引物二聚體
主要原因：
引物設(shè)計(jì)不合理，引物自身具有互補(bǔ)性
引物濃度不適
鎂離子濃度過高，退火溫度過低
解決方法：
重新設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行BLAST檢測
降低鎂離子濃度，提高退火溫度
增加模板用量
提高PCR反應(yīng)特異性的方法
引物的設(shè)計(jì)
引物在模板cDNA的保守區(qū)設(shè)計(jì)，長度15-30bp，GC含量小于60%，3’端不超過連續(xù)三個(gè)G或C，堿基分布錯落有致，避免引物自身形成二聚體，設(shè)計(jì)完成之后，需進(jìn)行BLAST檢測，如果與其他基因不具有互補(bǔ)性，則可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
降落PCR
降落PCR是一種簡單的降低非特異性產(chǎn)物的PCR的優(yōu)點(diǎn)就是可以降低實(shí)驗(yàn)耗時(shí)，同時(shí)又可以優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的步驟。引物的設(shè)計(jì)決定退火溫度，退火溫度過高會使PCR效率過低，過低則會使非特異擴(kuò)增過多。這雖然可以通過反復(fù)嘗試來優(yōu)化，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力。降落PCR提供了一個(gè)較為簡易的優(yōu)化方法。先在較高的溫度下擴(kuò)增，此時(shí)雖然擴(kuò)增效率低，但非特異擴(kuò)增基本沒有。隨著退火溫度的降低，非特異擴(kuò)增會逐步增多。但由于此時(shí)特異的擴(kuò)增產(chǎn)物已經(jīng)達(dá)到一定的數(shù)量優(yōu)勢，因此會對非特異擴(kuò)增產(chǎn)生強(qiáng)烈的競爭抑制，從而大幅提高PCR的特異性和效率。
熱啟動擴(kuò)增
采用熱啟動方法進(jìn)行擴(kuò)增，是除了設(shè)計(jì)引物之外，提高PCR反應(yīng)特異性的方式。在一般的PCR反應(yīng)中，試劑的配置需在冰上進(jìn)行，且要將PCR儀預(yù)熱，這種方法就類似于熱啟動，能夠一定程度的抑制錯配。但是酶在低溫下也存在活性，只要體系中有DNA鏈存在，就會擴(kuò)增產(chǎn)生非特異性條帶。采用熱啟動的方法就是在達(dá)到變性溫度之抑制酶的活性，而有效的方法就是使用熱啟動酶或高保真酶去擴(kuò)增，它的原理就是采用化學(xué)修飾的方法封閉酶的活性中心，當(dāng)溫度上升到95℃時(shí)恢復(fù)活性，指導(dǎo)擴(kuò)增。
巢式PCR
采用巢式PCR進(jìn)行擴(kuò)增，在多輪擴(kuò)增結(jié)果中提高擴(kuò)增特異性和靈敏度。與普通PCR不同的是，它采用兩對引物進(jìn)行擴(kuò)增，先用對引物普通PCR，然后將輪擴(kuò)增的產(chǎn)物稀釋100倍后用第二對引物（巢式引物）二次擴(kuò)增。因此采用巢式PCR可以大大增加困難模板擴(kuò)增的特異性和有限靶序列的靈敏度。
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