RNA質(zhì)量控制
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1. 相關(guān)概念
RNA質(zhì)檢參數(shù)OD260/OD280、OD260/OD230的意義。
260、280、320、230nm下的吸光度分別代表了核酸、蛋白質(zhì)、鹽濃度和有機(jī)溶劑的值。
A230: 測(cè)定其它碳源物質(zhì)，如酚，糖類等。
A260：核酸的吸收峰測(cè)，測(cè)RNA，DNA，引物等的濃度用的。
A280：蛋白質(zhì)的吸收峰。
一般的，我們只看OD260/OD280(Ratio，R)在1.8~2.1范圍內(nèi)時(shí)，我們認(rèn)為 RNA中蛋白的污染是可以容忍的，不過(guò)要注意，當(dāng)用Tris作為緩沖液檢測(cè)吸光度時(shí)，R 值可能會(huì)大于 2（一般應(yīng)該是<2.2的）。當(dāng)R < 1.8時(shí)，溶液中蛋白的污染比較明顯，可以根據(jù)自己的需要決定這份RNA 的命運(yùn)。當(dāng)R > 2.2時(shí)，說(shuō)明RNA已經(jīng)水解成單核酸了。純RNA的OD260/OD280的比值為2.0。
2. RNA質(zhì)量檢驗(yàn)
RNA樣品的品質(zhì)檢測(cè)一般分為總量，純度與完整性三大項(xiàng)�？偭浚何⒘糠止夤舛扔�(jì)測(cè)260nm吸收值計(jì)算。
純度：微量分光光度計(jì)測(cè)260nm/230nm吸收值的比值，用于評(píng)估有機(jī)溶劑殘留；260nm/280nm吸收值的比值，用于評(píng)估蛋白質(zhì)污染比例。
完整性：以Agilent Bioanalyzer進(jìn)行毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis)，并以軟件的RIN(RNA Integrity Number)分?jǐn)?shù)評(píng)估，10為RNA完整性zui好，0為差。2.1 RNA純度
RNA在純化過(guò)程中容易受到DNA、蛋白質(zhì)及有機(jī)溶劑的影響，這些殘存物將會(huì)影響以后的操作。光譜分析(NANODROP)利用物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸收度的不同，可以鑒別出溶液純度及濃度。RNA溶液的A260/A280的比值是一種RNA純度檢測(cè)方法，比值范圍一般為1.8-2.1。各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)對(duì)RNA純度要求不一，比如即使比值超出這個(gè)范圍，RNA樣品也一樣可以用于一些普通實(shí)驗(yàn)中，如Northern
雜交、RT-PCR、熒光定量PCR和RNA酶保護(hù)等實(shí)驗(yàn)。RNA Purity test: 1. protein contamination
OD260/OD280 ratio: 1.8-2.1 recommended 2. Organic solvent contamination: OD260/OD230 ratio: > 1.8 recommended OD260/OD270 ratio: > 1.2 recommended 2.2 RNA完整性
除純度以外，RNA的完整性也非常重要。自然界無(wú)所不在的RNase使RNA保
存相當(dāng)不易。由于RNase廣泛存在而穩(wěn)定，一般反應(yīng)不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNase就會(huì)引起RNA在制備與分析過(guò)程中的降解。1）電泳法
2）流式芯片(2100 Bioanalyzer)
電泳顯示有無(wú)基因組DNA污染，有無(wú)RNA降解(28S, 18S條帶)；通過(guò)目測(cè)28S和18S條帶的比例可以初步評(píng)價(jià)總RNA的質(zhì)量。一般認(rèn)為28S:18S >= 2可以初步判定總RNA完整性較好。跑電泳，RNA應(yīng)出現(xiàn)清楚的兩條Band (28S/18S rRNA)，有時(shí)會(huì)有第三條band (5S rRNA)，上方不可出現(xiàn)DNA污染條帶，28S/18S應(yīng)近似兩倍。28S和18S核糖體RNA條帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），在加樣孔位于圖片上方的看圖模式下，上面一條帶（28S）的密度大約是下面一條帶（18S）的2倍。下方還有可能觀察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA等）組成。在28S和18S 核糖體帶之間一般可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過(guò)程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會(huì)在28S核糖體帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，此時(shí)zui好需要對(duì)總RNA進(jìn)行純化。RNA的降解則表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。上述方法可以清楚分析RNA的完整性，但需樣本量過(guò)多。流式技術(shù)需求量降到25ng，除28S，18S外不應(yīng)該有其他峰值，28S/18S應(yīng)該在1.8-2.1之間。Integrity test by electrophoresis
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